Thomas Eggermann1, Matthias Begemann1, Gerhard Binder2, Sabrina Spengler1

1RWTH Aachen, Institute of Human Genetics, Aachen, Germany

摘要：父母源印記基因特異表達影響出生前生長的各個方面。因此可以預測許多目前已知的以生長障礙為臨床特征的印記疾?。╥mprinting disorders，IDs)。賽爾沃-拉賽爾綜合癥（Silver-Russell syndrome，SRS)是一種重要的印記疾病，這是一種先天性疾病，以子宮內和出生后生長受限、相對巨頭畸形、三角形面孔、不對稱并在將來不典型為特征。但是臨床譜寬闊，通常依主觀臨床診斷。僅50%的典型SRS特征的病人檢測出遺傳學和外成障礙，幾乎1/10的病人攜帶有染色體7的母性單親二體(UPD(7)mat)，38%以上的病人表現為11p15內印記控制區(qū)域1的低甲基化，1%以上的病人表現為微觀的染色體畸變。有趣的是，~7%的11p15低甲基化攜帶者，可檢測到其它基因座的脫甲基化。臨床上，這些病人與單純11p15 低甲基化的病人沒有區(qū)別，而UPD(7)mat的病人一般表現出輕度表型。但是，并不能夠描述清晰的基因型-表型的關系。因此，我們提出診斷11p15低甲基化、UPD(7)mat和隱秘染色體不平衡的典型SRS表型病人的診斷程序。也可用于回憶有該疾病的輕度臨床征兆的病人。

（Orphanet Journal of Rare Diseases 2010, 5:19）

回顧

最近20年來，越來越清楚低看到基因組印記與人類疾病密切相關。父母源印記基因的特異表達涉及到出生以前生長和行為的不同方面，目前已知的許多先天性印記疾病（imprinting disorders，IDs)以臨床生長障礙為特征。雖然Angelman綜合癥、Prader-Willi綜合癥和Beckwith-Wiedemann綜合癥(BWS)是已經完全確認的IDs，但對于賽爾沃-拉塞爾綜合癥（Silver-Russell syndrome，SRS)的印記檢測還是相對較新的結果。

SRS的主要特征為嚴重子宮內和出生后生長受限、相對巨頭畸形、典型矮小和三角臉。這種疾病還伴有第五手指先天性側彎和半發(fā)育不全（表1）的畸形特征。雖然最近提出了輔助診斷的臨床打分系統，但診斷的準確性受到臨床醫(yī)生經驗的影響。而且，成年SRS的臨床癥狀不如兒童期初期那樣清晰。

目前SRS的發(fā)生率尚未知，但由于特征范圍寬大而存在漏診的可能性。

SRS家族性病例以及細胞發(fā)生畸變的典型遺傳學發(fā)現，證實了SRS病因中遺傳學因素的影響。大部分SRS病例為散發(fā)的，但已經報告了家族性病例。Duncan et al.提出，大部分家族性病例以常染色體顯性方式遺傳，具有顯著的家庭內可變性。在8個家庭也假設存在常染色體隱性遺傳，但其中的6個家庭的臨床病歷存有疑問，但在僅有的2個家庭中就多次出現了11p15后成突變。

在下面，將討論目前已知的SRS后成突變。我們要指出的是突變的次序并不反映重要性，而是鑒別的年代。

染色體畸變與SRS

幾名SRS病人具有許多染色體受累的結構畸變，但只有染色體7，11和17符合嚴格SRS診斷標準。根據兩名17q24-q25病人的平衡易位，曾經長時間討論了該染色體區(qū)域在SRS病因中的重要作用。但是，兩名病人17q斷點的特性表明二者是不一樣的。目前認為，所報告的17q上生長激素基因簇的雜合性缺失是一種致病的多態(tài)性。

然而，過去使用低微觀分辨率妨礙了常規(guī)細胞發(fā)生學分析，因此，現在的陣列技術的分子學核型分析可鑒別出以前微觀分析所不能的隱秘不平衡。在這期間，兩項研究報告了攜帶<3Mb的小缺失/重復的SRS病人。關于遺傳咨詢，應當考慮病人父母的常規(guī)核型分析，以檢測平衡的重排。

染色體7與SRS

在幾名SRS病人，已經鑒別出的染色體7的細胞遺傳學異常包括7p11.2p13重復和小標記染色體。該染色體成為病因的最初證據為，~10%的SRS病人鑒別出了染色體7的母性單親二體（表1），幾乎所有這些UPD(7)mat攜帶者的微衛(wèi)星分型模式均一致性地具有三染色體自救機制。由于UPD(7)mat源自三染色體，所以可以假設三體性7鑲嵌性（trisomy 7 mosaicism）是SRS的病因。這個假設被SRS病人完全偏斜的X失活頻數的增加所確證，X失活是未在病人和/或胎盤檢測出三體性7的生物學標志。不過，兩項研究在SRS病人的白細胞和成纖維細胞中均未檢測出三體性7細胞，可能是因為三體性7鑲嵌性的致命性和所分析的細胞數量有限。

在UPD病例，隱性等位基因的純合性是異常表型的又一病因，而且，確實是首先在生長延遲的囊性纖維化病人報告了UPD，這名病人因UPD(7)mat引起純合子囊性纖維化跨膜調節(jié)基因突變。因此，隱性突變可能是這名UPD(7)mat病人SRS表型的病因，但是不存在常見的單親二體型部分，這個結果排除了隱性基因是直接導致SRS的病因。

總之，UPD(7)mat攜帶者SRS表型最可能的解釋是染色體7上印記基因失常表達。UPD(7)mat通常與生長延遲和SRS-樣特征有關，而UPD(7)pat則無關。因此，假設：染色體7上的（i）父性基因表達的減少或（ii）母性基因的過表達引起SRS。

迄今為止，對染色體7編碼因子的研究集中在了7p和7q染色體片段上面。對于7p11.2-p13候選區(qū)域，已經報告了SRS病人的重復，這個區(qū)域含有印記基因（生長因子受體結合蛋白10/GRB10）和幾種涉及人類生長和發(fā)育的因子(IGFBP1; IGFBP3; PHKG1; EGFR; GHRHR)。在SRS，已經排除了這些基因的病理性突變，特別是，GBR10對生長具有重要作用，因此仍然是SRS的候選者。這個假設得到了最近發(fā)表的攜帶母親遺傳的dup(7)(p11.2p12)的家庭并未包括GRB10，也無SRS特征的支持。然而，盡管進行了廣泛的篩查研究，但在SRS病人的這個編碼區(qū)域即未檢測出點突變，也未檢測出GRB10的異常甲基化。

另一方面，也有SRS病因涉及到染色體7q31區(qū)域的證據：已經鑒別出有UPD(7q)片段的4名生長延遲病人，在7q31中有3個印記基因(MEST/PEG1; CPA4; COPG2)和2個非編碼RNAs(MESTIT, CIT1/COPG2IT1)，但篩查研究未檢測出病理性變異體。此外，在SRS病人的MEST/PEG1基因座仍未檢測出其它印記疾病所報告的單純印記缺失。

也有報告，其它染色體UPDs引起的子宮內生長延遲，通常與人類妊娠期胎盤鑲嵌性有關，幾項報告在SRS病人使用微衛(wèi)星分型研究了其它染色體，但并未觀察到其它的UPDs。

染色體11p15與SRS

最大的SRS的分子遺傳學亞組是11p15染色體區(qū)域后成突變和突變的病人。這個區(qū)域涉及SRS病因的最早的證據是在生長延遲病人鑒別出了母性11p15重復，6名中的4名病人，除了子宮內生長受限和出生后生長延遲外，表現出SRS特征。有趣的是，與其相對的障礙-父性11p15重復與BWS有關。在BWS病人可檢測出許多遺傳與外成的變化，但50%以上為11p15的異常甲基化。因此，才在SRS病人搜索11p15后成突變，并確實在38~63%的病人發(fā)現調節(jié)H19和IGF2表達的11p15內端粒ICR1低甲基化（表2）。

11p15印記簇包括有許多印記基因，其表達受到2個不同印記控制區(qū)域(ICR1和ICR2)的調節(jié)，也分別稱為H19 DMR（分化的甲基化區(qū)域）和KvDMR1（見圖1），對于胎兒的生長至關重要。

端粒ICR1調節(jié)2個父母等位基因特異的染色質結構，導致H19和IGF2呈彼此相反的表達。在胚胎發(fā)育過程中，2基因在源自內胚層和中胚層的組織中表達，競爭相同的增強子。父性表達的IGF2參與胎兒的發(fā)育和生長。雖然H19是最早鑒別出的非編碼轉錄物之一，但是它的功能仍然不清楚。敲除H19，去除全部RNA編碼序列但保留啟動子和周圍轉錄單位并不影響IGF2的印記表達。這些結果說明，RNA本身不具功能，但是在哺乳類，H19是相對高度保守的基因（人和鼠之間有77%的一致性）的事實提示了密切的功能聯系。最近的研究表明，H19功能是作為基本的小RNA前身物，在脊椎動物發(fā)育過程中參與特定mRNA轉錄后的下調。在H19下游2 kb分化的甲基化區(qū)域內，ICR1有7個CTCF靶位點(CTCF1- CTCF7)，鋅指結合因子CTCF結合母性未甲基化的ICR1拷貝，因此形成染色質邊界。這種CTCF結合機制阻斷了IGF2表達，促進母性11p15拷貝H19的轉錄。

著絲粒ICR2調節(jié)CDKN1C, KCNQ1（鉀通路KQT家族成員1）和更多基因彼此相反的表達，并只在母性等位基因上甲基化。在40%的家族性BWS和5~10%的散發(fā)病例，父性的突變抑制CDKN1C基因（表1）。該基因編碼細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(p57KIP2)，是p21CIP2Cdk抑制因子家族的一部分。兩名BWS病人CDKN1C胚層突變的功能分析證明了細胞周期抑制的降低。11p15內另一個非編碼RNA的基因- KCNQ1OT1 (LIT1)位于KCNQ1基因的內含子9。KCNQ1OT1由父性等位基因表達，可能抑制CDKN1C基因功能的實現。母性ICR2等位基因的甲基化降低(LOM)與KCNQ1OT1的表達有關。在BWS，ICR2后成突變（ICR2低甲基化）以及CDKN1C點突變引起的一個重要生理學變化是CDKN1C的表達減少。

SRS的11p15后成突變主要是端粒ICR1低甲基化（表1）。與此相反，BWS最常見的變化是~50%的病人著絲粒ICR2低甲基化，而僅在2~7%的BWS病人診斷為ICR1超甲基化。臨床上，大多ICR1低甲基化攜帶者符合SRS臨床標準，但在僅有生長延遲和不對稱的病人也已經診斷出后成突變?？墒?，在單純出生前和出生后生長受限的病人尚未監(jiān)測到這種障礙。

最近鑒別的SRS染色體重復的病人僅限于ICR2，提示了11p15上的兩個ICRs都是這種疾病的病因，如同BWS。該結果和由BWS病人獲得的進一步的數據，以及在小鼠的研究提示，ICR1和ICR2相互作用。

11p15低甲基化的孕后起因與SRS的多基因座異常甲基化

幾乎所有SRS病人11p15后成突變的鑲嵌分布都可能貢獻于孕后錯誤。臨床上，這種嵌合體反映為偏側發(fā)育不全，大部分病人均存在這種臨床表現。

雙生子研究數據與后成突變的嵌合體分布相一致。在SRS，觀察到了4對不一致和僅有的1對一致的單卵雙生對。這種不明確的結果與Gicquel et al.的數據相一致。他們報告了血液細胞ICR1后成突變攜帶者雙生子對的不一致，但受累的雙生子皮膚成纖維細胞中存在LOM。對于ICR2基因座也有類似的觀察，不一致的BWS雙生子對的淋巴細胞有相同外成缺陷，但在成纖維細胞或口腔粘膜中有不同的甲基化模式。最終，ICR1或ICR2后成突變的孕后起因解釋了SRS或BWS雙生子對不一致的高發(fā)生率。

確定印記標記中的合子后缺陷的進一步證據來源于短暫的新生兒糖尿病(TNDM)病人，以及除了甲基化缺陷外有更多母性（和父性）印記基因座LOM的SRS和BWS病人的觀察。在TNDM情況下，又有LOMs表現的病人表型與TNDM和僅在6q24有LOM病人稍有不同，可能是由于其它印記基因座甲基化改變所致。根據這些研究結果，Mackay et al.提出了母性低甲基化綜合癥的存在。最近，也報告了血液淋巴細胞多基因座低甲基化的BWS和SRS病人。這些病人白細胞中的父性和母性印記基因座都受累。在不一致的BWS單卵雙生子，Bliek et al.在雙生子對雙方白細胞中觀察到了類似的一個或多個基因座印記異常，但在頰粘膜DNA中，只在受累的雙生子中可檢測到后成突變。在所有的研究中，有多重低甲基化基因座的BWS或SRS病人與攜帶單純11p15后成突變病人之間的表型差異不明顯。

總結不同疾病的數據，異常甲基化鑲嵌體提示受孕后出現了外成錯誤，影響了印記基因座甲基化信號的保持。原生殖細胞中的甲基化模式被大部消除，特定性別的甲基化模式在成熟的男女生殖細胞中重新建立。這個過程的關鍵調節(jié)因素是DNA甲基轉移酶和甲基結合域蛋白，但是這些機制仍然在很大程度上未闡明。Howell et al.曾提出胚胎早期甲基化模式動力學復雜性的觀點以及建立和保持基因組甲基化模式的機制：DNA甲基轉移酶-1(Dnmt1)缺乏小鼠，在卵母細胞中正常建立基因組印記，但意想不到的是合子后甲基化的喪失。要維持印記基因座的甲基化可能需要Dnmt1，并且只在胚胎早期中的單一S時相中。在Dnmt3L-/-小鼠后代首次證實了規(guī)律印記的確立：當缺乏DNA甲基轉移酶3L(Dnmt3L)時，其它因子標記了各個特異甲基化區(qū)域(DMRs)，但對于所有基因座的適當印記模式，所有涉及因子的聯合是必需的。

SRS和SRS-樣特征病人的診斷程序

使用11p15內ICR1低甲基化和UPD(7)mat的鑒別，可對~50%的病人進行SRS臨床診斷的分子學確證（圖2）。

目前所有已知UPD(7)mat的病人是染色體不分離事件的結果，在這些情況下不增加家庭中的再現風險。其間，報告了幾名染色體7長臂UPD的病人。因此，檢測染色體7短臂和長臂已知印記基因座UPD(7)mat是有意義的。我們提議，使用甲基化特異的PCR方法檢測7p和7q基因座，因為這樣做不僅為診斷而檢測病人的UPD(7)mat，而且也可以檢測目前未知的染色體7上的單純印記缺陷。如果獲取陽性檢測結果，則需要微衛(wèi)星分型證實UPD(7)mat，排除前述的單純性印記缺陷和缺失。

在出生前檢測UPD的情況下，特異甲基化檢測可能受到甲基化是否完備的不確定性的妨礙，因此微衛(wèi)星分型是首選方法。

診斷程序包括MS-MLPA分析11p15基因座和染色體兩臂基因座的UPD(7)mat。MSA: 微衛(wèi)星分析; MS分析: 特異甲基化檢測)

大多數SRS病人表現出11p15內ICR1低甲基化。已經報告幾種檢測方法可用于11p15基因座的甲基化分析，甲基化特異的多重探針依賴性分析方法(MS-MLPA)的優(yōu)點是在單管中可以檢測11p15內不同基因座的拷貝數變異和異常甲基化，因此可以鑒別11p15內ICRs甲基化缺陷和重復，以及該區(qū)域的UPDs。但是MS-MLPA以及報告的其它檢測方法也具有局限性，例如影響探針雜交或重亞硫酸鹽轉換的序列變異體。此外，我們不要忘記，常規(guī)診斷依據于淋巴細胞，而且?guī)缀跛蠭CR1低甲基化的SRS病人為嵌合體。因此，我們假設，少數病人逃逸了分子學診斷，因為他們的鑲嵌性影響了血液細胞以外的組織。因此，在臨床強烈懷疑SRS而又排除了主要的后成障礙的情況下，我們建議分析另一種細胞系統，例如口腔上皮細胞。盡管異常甲基化的MS-MLPA模式是明確的，并且不需要再次檢測來證實，但重復/缺失和UPD要使用11p15標記微衛(wèi)星分型或qPCR來進行核實。當前，對于11p15印記區(qū)域特異甲基化檢測方法是否適用于出生前尚難以估價，因為胚胎中特定基因座甲基化開始時間不確定。

最近，在~7%的病人證實了除ICR1之外的其它基因座多種低甲基化。單純ICR1低甲基化病人與多印記缺陷病人之間的臨床差異普遍不明顯。為了研究的目的，可檢測ICR1脫甲基化病人的其它印記基因座，在排除了11p15后成突變和UPD(7)mat后，分子學核型分析可有助于鑒別亞微觀的不平衡。SRS染色體不平衡的出現頻數的確尚不了解，但根據對這一問題的2項研究，我們估價~1%的SRS病人存在這種畸變。

通過概括常規(guī)診斷SRS病例的分子遺傳學數據，我們證明了11p15后成突變和UPD（7）mat攜帶者并不總是表現為明確的SRS表型，在“SRS-樣”表型的病例也應當進行這兩種畸變的遺傳學檢測，例如，僅有前額突出和三角臉或不對稱臨床特征的輕微子宮內生長受限和出生后生長延遲(>-2SD)病人。特別是，不要機械地將有“SRS-樣”表型的非IUGR病人排除在分子學檢測之外。

總之，鑒于SRS的臨床診斷的主觀性，SRS的分子學驗證特別重要。關于遺傳咨詢，ICR1低甲基化或母性UPD7的鑒別由于重新發(fā)生而有低的再現風險。最初的臨床特征提示母性UPD7攜帶者的表型一般較輕，而11p15后成突變攜帶者通常表現出典型的SRS特征。進一步的表型分析將有助于闡明Binder et al.所提出的SRS的分子學亞組是否對生長激素治療有不同的反應。